實(shí)驗(yàn)室中常用層析技術(shù)
層析技術(shù)是近代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的分析方法之一，任何層析過(guò)程都是在兩個(gè)相中進(jìn)行的。一是固定于支持物上的固定相，另一是流經(jīng)固定相的流動(dòng)相，由于樣品中各組分理化性質(zhì)（如溶解度、吸附能力、分子形狀、分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量、分子表面的特殊基團(tuán)、分子量等）不同，表現(xiàn)出對(duì)固定相和流動(dòng)相的親和力各不相同。當(dāng)混雜物通過(guò)多孔的支持物時(shí)，它們受固定相的阻力和受流動(dòng)相的推力也不同，各組分移動(dòng)速度各異并在支持物上集中分布于不同的區(qū)域，從而各組分得以分離。
根據(jù)層析法中兩相的性質(zhì)和操作方法不同，層析法有許多類型，僅就幾種常用的方法介紹如下：
一、
親和層析(Affinity Chromatography)
親和層析法是近年來(lái)廣為重視并得到迅速發(fā)展的提純、分離方法之一。許多物質(zhì)都具有和某化合物發(fā)生特異性可逆結(jié)合的特性。例如：酶與輔酶或酶與底物（產(chǎn)物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑等），抗原與抗體，凝集素與受體，維生素與結(jié)合蛋白，凝集素與多糖（或糖蛋白、細(xì)胞表面受體），核酸與互補(bǔ)鏈（或組蛋白、核酸多聚酶、結(jié)合蛋白）以及細(xì)胞與細(xì)胞表面特異蛋白（或凝集素）等。親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過(guò)此層析柱時(shí)，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離提純的目的。
親和層析由于配體與待分離物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，所以分離提純的效率*，提純度可達(dá)幾千倍，是當(dāng)前zui為理想的提純方法。親和層析配體與待分離物質(zhì)特異性結(jié)合性質(zhì)還可用來(lái)從變性的樣品中提純出其中未變性部分，從大量污染的物質(zhì)中提純小量所需成分，親和層析還可用來(lái)從極度稀薄的液體中濃縮其溶質(zhì)。
親和層析所用的載體和凝膠過(guò)濾所要求的凝膠特性相同，即化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不帶電荷，吸附能力弱，網(wǎng)狀疏松，機(jī)械強(qiáng)度好，不易變形，保障流速的物質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠顆粒、葡聚糖凝膠顆粒以及瓊脂糖凝膠顆粒都可用，其中以瓊脂糖凝膠(Sephadex 4B)型應(yīng)用zui廣泛。親和層析的關(guān)鍵是設(shè)法選擇合適的配體并將此配體與載體化學(xué)連接起來(lái)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，這需要在實(shí)際工作中根據(jù)需要加以選擇和試驗(yàn)。
二、分配層析（Partition Chromatography）
分配層析是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的層析技術(shù)，相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑抽提方法。
在分配層析中，固定相是極性溶劑（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此類溶劑能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素粉，濾紙等)緊密結(jié)合，使呈不流動(dòng)狀態(tài)；流動(dòng)相則是非極性的有機(jī)溶劑。分配系數(shù)(a)是指在一定溫度
和壓力條件下達(dá)到平衡，物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相兩部分的濃度比值。
分配系數(shù)（a）= | 物質(zhì)在固定相中的濃度 |
物質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度 |
在層析過(guò)程中，當(dāng)有機(jī)溶劑流動(dòng)相流經(jīng)樣品點(diǎn)時(shí)，樣品中的溶質(zhì)便按其分配系數(shù)部分地轉(zhuǎn)入流動(dòng)相向前移動(dòng)。當(dāng)經(jīng)過(guò)前方固定相時(shí)，流動(dòng)相中的溶質(zhì)就會(huì)進(jìn)行分配，一部分進(jìn)入固定相。通過(guò)這樣不斷進(jìn)行的流動(dòng)和再分配，溶質(zhì)沿著流動(dòng)方向不斷前進(jìn)。各種溶質(zhì)由于分配系數(shù)不同，向前移動(dòng)的速度也各不相同。分配系數(shù)較大的物質(zhì)，由于分配在固定相多些，分配在流動(dòng)相少些，溶質(zhì)移動(dòng)較慢；而分配系數(shù)較小的物質(zhì)，流動(dòng)速度較快。從而將分配系數(shù)不同的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。
在紙層析中，Rf值的大小主要取決于該組分的分配系數(shù)。分配系數(shù)大者移動(dòng)速度慢，Rf值也?。环粗峙湎禂?shù)小者移動(dòng)速度快Rf值也大。因?yàn)槊糠N物質(zhì)在一定條件下對(duì)于一定的溶劑系統(tǒng)，其分配系數(shù)是一定的，Rf值也恒定。因此可以根據(jù)Rf值對(duì)分離的物質(zhì)進(jìn)行鑒定。支持物在分配層析中起支持固定相的作用，根據(jù)其使用方式也分柱層析和薄層層析兩種。用濾紙做支持物的紙層析法是zui常用的分配層析。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用厚度適當(dāng)、質(zhì)地均一、含金屬離子(鈣、銅、鎂、鐵等)盡量少的濾紙為支持物。濾紙中吸附著的水（約含20-22%）是常用的固定相。酚、醇是常用的流動(dòng)相。展層方法多可采用垂直型（圖1-10），也可采用水平型。把欲分離的樣品點(diǎn)加于紙的一端，使流動(dòng)相經(jīng)此移動(dòng)，這樣在兩相間就發(fā)生分配現(xiàn)象。根據(jù)樣品中各組中的分配系數(shù)不同，它們就逐漸集中于紙上不同的部位。各組分在濾紙上的移動(dòng)速度可用Rf值來(lái)表示。
Rf = | 溶質(zhì)層析點(diǎn)心到原點(diǎn)心的距離 |
溶劑前沿到原點(diǎn)心的距離 |
有時(shí)幾種成分在一個(gè)溶劑系統(tǒng)中層析所得Rf值相近，不易分離清楚。這時(shí)可以在第-一次層析后將濾紙吹干逆轉(zhuǎn)90 o角，再采用另一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行第二次層析，往往可以得到滿意的分離效果。這種方法稱為“雙向紙層析法”（圖1-11），以與一般的“單向紙層析”相區(qū)別。
三、離子交換層析（Ion-exchange Chromatography）
離子交換層析是利用離子交換劑對(duì)需要分離的各種離子具有不同的親和力（靜電引力）而達(dá)到分離目的的層析技術(shù)。離子交換層析的固定相是離子交換劑，流動(dòng)相是具有一定pH和一定離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液。
離子交換劑是具有酸性或堿性基團(tuán)的不溶性高分子化合物，這些帶電荷的酸性或堿性基團(tuán)與其母體以共價(jià)鍵相連，這些基團(tuán)所吸引的陽(yáng)離子或陰離子可以與水溶液中的陽(yáng)離子或陰離子進(jìn)行可逆的交換。因此根據(jù)可交換離子的性質(zhì)將離子交換劑分為兩大類：陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑（圖1-12）。
據(jù)離子交換劑的化學(xué)本質(zhì)，可將其分為離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維素和離子交換葡聚糖等多種。
離子交換樹(shù)脂是人工合成的高分子化合物，生化實(shí)驗(yàn)中所用的離子交換樹(shù)脂多為交聯(lián)聚苯乙稀衍生物。離子交換樹(shù)脂多用于樣品去離子，從廢液中回收所需的離子和水的處理等。由于它可使不穩(wěn)定的生物大分子變性，因此不適用于對(duì)生物樣品進(jìn)行分離。
CH2OCH2.CH2.N+H.(CH2CH3)2 |
離子交換纖維素（圖1-13）可用于生物大分子的分離。其缺點(diǎn)是分子形態(tài)不規(guī)則，孔隙不均一，對(duì)要求非常嚴(yán)格的試驗(yàn)尚不夠滿意。
較為理想的離子交換劑是離子交換葡聚糖凝膠和離子交換瓊脂糖凝膠。它們具有顆粒整齊，孔徑均一等優(yōu)點(diǎn)，往往得到較好的分離效果。
離子交換層析的基本過(guò)程是：離子交換劑經(jīng)適當(dāng)處理裝柱后，應(yīng)該先用酸或堿處理（視具體情況可用一定pH的緩沖液處理），使離子交換劑變成相應(yīng)的離子型（陽(yáng)離子交換劑帶負(fù)電并吸引相反離子H+，陰離子交換劑帶正電并吸引相反離子OH-）加入樣品后，使樣品與交換劑所吸引的相反離子（H+或OH-）進(jìn)行交換，樣品中待分離物質(zhì)便通過(guò)電價(jià)鍵吸附于離子交換劑上面（圖1-14）。然后用基本上不會(huì)改變交換劑對(duì)樣品離子親和狀態(tài)的溶液（如起始緩沖液）充分沖洗，使未吸附的物質(zhì)洗出。洗脫待分離物質(zhì)時(shí)常用的兩種方法，一是制作電解質(zhì)濃度梯度，即離子強(qiáng)度梯度。通過(guò)不斷增加離子強(qiáng)度，吸附到交換劑上的物質(zhì)根據(jù)其靜電引力的大小而不斷競(jìng)爭(zhēng)性的解脫下來(lái)；二是制作pH梯度，影響樣品電離能力，也使交換劑與樣品離子親和力下降，當(dāng)pH梯度接近各樣品離子的等電點(diǎn)時(shí)，該離子就被解脫下來(lái)。在實(shí)際工作中，離子強(qiáng)度梯度和pH梯度可以是連續(xù)的（稱梯度洗脫），也可以是不連續(xù)的（稱階段洗脫）。一般來(lái)講，前者分離的效果比后者的分離效果理想，梯度洗脫需要梯度混合器來(lái)制造離子強(qiáng)度梯度或pH梯度。圖1-15是zui簡(jiǎn)單的梯度混合器，它由兩個(gè)容器組成，兩容器之間以連通管相連接，與出口連接的容器裝有攪拌裝置，內(nèi)盛起始洗脫液，此洗脫液代表開(kāi)始洗脫的離子強(qiáng)度（或起始pH）；另一容器內(nèi)盛有終末洗脫液，此洗脫液代表洗脫的zui后離子強(qiáng)度(或zui后pH)。在洗脫過(guò)程中，由于終末洗脫液不斷進(jìn)入起始洗脫液中，并不斷被攪拌均勻，所以流出的洗脫液成分不斷的由起始狀態(tài)向終末狀態(tài)演變形成連續(xù)的梯度變化。
四、凝膠過(guò)濾(Gel Filtration)
凝膠過(guò)濾是利用具有一定口徑范圍的多孔凝膠的分子篩作用對(duì)生物大分子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。當(dāng)樣品隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)由凝膠組成的固定相時(shí)，分子量大的物質(zhì)不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，于是隨流動(dòng)相流經(jīng)顆粒之間的狹窄空隙，首先洗脫出層析柱；分子量小的物質(zhì)可以擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，比較大分子量物質(zhì)流經(jīng)的載面積寬，流動(dòng)速度慢，于是與分子量大的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，zui后被洗脫出來(lái)（圖1-16）。即固定相的網(wǎng)孔對(duì)不同分子量的樣品成分具有不同的阻滯作用，使之以不同的速度通過(guò)凝膠柱，從而達(dá)到分離的目的，凝膠過(guò)濾又因此得名“分子篩層析”和“凝膠排阻層析”。
凝膠柱的總體積（Vt）：凝膠顆粒之間空隙的體積（外水體積Vo）、凝膠顆粒網(wǎng)眼內(nèi)的體積（內(nèi)水體積Vi）和凝膠顆?；|(zhì)本身的體積（Vr）的總和（圖1-17）。在實(shí)際工作中，對(duì)于同一個(gè)凝膠柱來(lái)說(shuō)，各種分子量的物質(zhì)有其固定的洗脫體積。因此，準(zhǔn)確掌握凝膠柱的一些基本因素是十分有益的。
Vt=Vo+Vi+Vr
如果被分離的物質(zhì)分子量很大，*不能進(jìn)入網(wǎng)孔內(nèi)，那末它從柱上洗脫下來(lái)（小樣品時(shí)以洗脫峰為準(zhǔn)）所需的洗脫液體積（Ve）就等于顆粒間隙的體積（Vo），即Ve=Vo。如果被分離物質(zhì)的分子量極小，可以非常自由的通過(guò)網(wǎng)孔即進(jìn)出凝膠顆粒，那么它的洗脫液體積就應(yīng)當(dāng)?shù)扔陬w粒內(nèi)和顆粒間隙體積的總和（Ve=Vo+Vi）。至于分子量位于上兩者之間的，其洗脫體積便位于Vo和Vo+Vi之間?？梢?jiàn)，分子量大小不同的物質(zhì)，其洗脫體積不同，從而可以用于物質(zhì)的分離。另外，如果在有已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做對(duì)照的條件下，就可以根據(jù)洗脫體積來(lái)估計(jì)待測(cè)物質(zhì)的分子量。
Sephadex G-200（超細(xì)顆粒）柱2.6×70cm，洗脫液：0.05mol/L鉀緩沖液，內(nèi)含0.1 mol/LNaCl及0.02%NaN3，流速1ml/cm2/hr。
1．過(guò)氧化氫酶（210，000）
2．醛縮酶（158，000）
3．牛血清蛋白（67，000）
4．卵清蛋白（43，000）
5．原A（25，000）
6．核糖核酸酶A（13，700）
凝膠過(guò)濾除用于生物大分子的分離、分子量測(cè)定外，還可用于提純、脫鹽和復(fù)合物組分成分分析等。
吸附層析(Absorption Chromatography)
吸附作用是指某些物質(zhì)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。吸附劑吸附能力的強(qiáng)弱與被吸附物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶劑的本質(zhì)和吸附劑的本質(zhì)有關(guān)。當(dāng)改變吸附劑周圍溶劑成分時(shí)，吸附劑對(duì)被吸附物質(zhì)的親和力便發(fā)生變化，使被吸附物質(zhì)從吸附劑上解脫下來(lái)，這一解脫過(guò)程稱為“洗脫”或“展層”。
吸附層析是把吸附劑裝入玻璃柱內(nèi)（吸附柱層析法）或鋪在玻璃板上（薄層層析法），由于吸附劑的吸附能力可受溶劑影響而發(fā)生改變，樣品中的物質(zhì)被吸附劑吸附后，用適當(dāng)?shù)南疵撘簺_洗，改變吸附劑的吸附能力，使之解吸，隨洗脫液向前移動(dòng)。當(dāng)解吸下來(lái)的物質(zhì)向前移動(dòng)時(shí)，遇到前面新的吸附劑又重新被吸附。此被吸附的物質(zhì)再被后來(lái)的洗脫液解脫下來(lái)。經(jīng)如此反復(fù)的吸附-解吸-再吸附-再解吸的過(guò)程，物質(zhì)即可沿著洗脫液的前進(jìn)方向移動(dòng)。其移動(dòng)速度取決于吸附劑對(duì)該物質(zhì)的吸附能力。由于同一吸附劑對(duì)樣品中各組分的吸附能力不同，所以在洗脫過(guò)程中各組分便會(huì)由于移動(dòng)速度不同而逐漸分離出來(lái)，這就是吸附層析的基本過(guò)程。
實(shí)驗(yàn)中常用的固體吸附劑有氧化鋁、硅酸鎂、鈣、氫氧化鈣、florsit、活性鈣、蔗糖、纖維素和淀粉。常用的洗脫液有乙烷、苯乙醚、氯-仿，以及乙醇、丙酮或水與有機(jī)溶劑形成的各種混合物，吸附層析通常用于分離脂類、類固醇類、類胡羅卜素、葉綠素以及它們的前體等非極性和極性不強(qiáng)的有機(jī)物。
值得提出的是，幾乎所有的溶質(zhì)對(duì)于所有的層析介質(zhì)，即使是惰性的物質(zhì)都有一定限度的吸附力，除吸附層析本身之外，吸附作用還或多或少地存在于所有其他類型的層析中。
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