快速檢測食品中黃曲-mei素
總黃曲霉--毒素(AFs)酶聯(lián)免疫測試方法介紹
一、黃曲-mei素afs快速檢測的意義：黃曲霉-毒素是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。主要污染玉米、花生、堅(jiān)果等。天然污染的黃曲霉-毒素以AFB1、AFB2、AFG1、AFG2為主，總黃曲霉-毒素一般指這四種毒素的總量。黃曲-霉毒素屬于zui強(qiáng)烈的天然致癌物質(zhì)，肝臟是其主要的靶器官，其中AFB1毒性zui強(qiáng)，具有*的急性毒性和致癌性。其檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)，本試劑盒可以準(zhǔn)確快速檢測糧谷類和花生及飼料中的總黃曲-霉毒素。
二、黃曲-mei素測定原理：利用用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，利用間接競爭ELISA法進(jìn)行測定。用抗原包被微孔板，加入黃曲-霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、總黃曲霉-毒素單克隆抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)后，將未與包被抗原結(jié)合的抗體洗去;再加入酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗體孵育，加入底物顯色，終止液終止后，用酶標(biāo)儀在450nm處測定OD值。
三、快速檢測實(shí)驗(yàn)操作所需的試劑及材料：微孔板 包被有AFB1-BSA；5個(gè)濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液各(1mL)可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)1：0ng/mL 可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)2：1.0ng/mL可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)3：2.0ng/mL 可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)4：5.0ng/mL可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)5：10.0ng/mL 可直接使用；AFS單克隆抗體溶液(6mL)可直接使用；酶標(biāo)物(12mL)可直接使用；顯色液(12mL)；終止液(6mL)；濃縮洗液(30mL) ；空白對(duì)照(6ml)微孔板酶標(biāo)儀(含450nm)：定量分析用；振蕩器，粉碎機(jī)，微量移液器，量筒，漏斗和容量瓶，快速定性濾紙；試劑：氯化鈉(分析純)、甲醇(分析純)、去離子水或蒸餾水
四、檢驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有黃曲-霉毒素，應(yīng)特別小心。使用過的玻璃容器及黃曲-霉毒素溶液zui-好用pH7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡過夜。終止液為0.5N硫酸，避免接觸皮膚。不要交換使用不同批號(hào)盒中的試劑。
五、黃曲-mei素檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)樣品前處理：樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存，取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化鈉及25mL70% 甲醇-水，強(qiáng)力振蕩3分鐘；用快速定性濾紙過濾；取1mL濾液，用1%氯化鈉溶液稀釋10倍；取50μL稀釋液進(jìn)行分析；據(jù)需要可以增加樣品量，但甲醇溶液的量也應(yīng)相應(yīng)增加。
六、檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)和測定程序：每次加樣后立即將所有試劑放回2-8 ℃，每步操作時(shí)間控制在5min內(nèi)， 孵育過程中應(yīng)避光。測定程序1. 取所需數(shù)量的板條插入微孔架，記錄樣品及標(biāo)準(zhǔn)的位置。2. 加入50mL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到微孔，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。3. 將50mL抗總黃曲-霉毒素單克隆抗體使用液加入到每個(gè)微孔(注意移液器管尖不要接觸到放進(jìn)孔中的液體，避免交叉污染)，在適當(dāng)位置孔加空白對(duì)照液100mL，37℃孵育90min。4. 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。5. 每孔加入酶標(biāo)物100mL，37℃孵育60min。6. 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。7. 每孔加入顯色液100mL(2滴)，37℃孵育10 min -12min。8. 每孔加入終止液50mL(1滴)，立即用酶標(biāo)儀在波長為450nm處測定吸光度值(OD值)。
黃曲-霉毒素B1(AFB1)酶聯(lián)免疫定量檢測方法
一、黃曲-mei素含義和檢測原理：黃曲-霉毒素是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要污染玉米、花生、堅(jiān)果等。天然污染的黃曲-霉毒素以AFB1為主，AFB1屬于強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，肝臟是其主要的靶器官，具有*的急性毒性和致癌性。AFB1檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和ELISA方法，本試劑盒是以應(yīng)用單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA檢測方法，可以準(zhǔn)確快速檢測糧谷類和花生及飼料中的AFB1。測定原理才采用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，利用間接競爭ELISA法進(jìn)行測定。用抗原包被微孔板，加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、抗AFB1單克隆抗體進(jìn)行孵育后，將未與包被抗原結(jié)合的抗體洗去;再加入酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗體孵育，加入顯色液，經(jīng)過終止液終止后，用酶標(biāo)儀在450nm處測定OD值。
二、實(shí)驗(yàn)所需提供的耗材物品：微孔板包被有AFB1-BSA5個(gè)濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(各0.5mL)。標(biāo)準(zhǔn)1：0ng/mL可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)2：0.1ng/m可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)3：0.2ng/mL可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)4：0.5ng/m可直接使用；標(biāo)準(zhǔn)5：1.0ng/m可直接使用；抗AF B1單克隆抗體溶液(6mL)可直接使用；酶標(biāo)物(12mL)可直接使用；顯色液(12mL)可直接使用；終止液(6mL)可直接使用；濃縮洗液(30mL) 稀釋使用；微孔板酶標(biāo)儀(可于450nm處測定)、振蕩器、粉碎機(jī)、微量移液器；量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙；氯化鈉(分析純)、甲醇(分析純)、去離子水或蒸餾水。
三操作者注意事項(xiàng)：1、標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有黃曲-霉毒素，應(yīng)特別小心。2、使用過的玻璃容器及黃曲-霉毒素溶液zui-好用pH7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡過夜。3、終止液含有硫酸，避免接觸皮膚。4、每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。5、每步加樣時(shí)間應(yīng)控制在5min內(nèi)。6、孵育過程中應(yīng)避光。不要交叉使用不同批號(hào)的試劑。實(shí)驗(yàn)試劑儲(chǔ)存條件：保存試劑盒于2~8℃；不要冷凍.顯色液對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；將不用的微孔板放進(jìn)原鋁箔袋中，置2~8℃保存。
四、實(shí)驗(yàn)測試樣品的處理：樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存；取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化鈉及25mL70%甲醇-水溶液；強(qiáng)力振蕩3分鐘；用快速定性濾紙過濾；取1mL濾液，加水4mL進(jìn)行稀釋；取50μL稀釋液進(jìn)行分析；根據(jù)需要可以增減樣品量，但甲醇-水溶液的量也應(yīng)相應(yīng)增減。
五、檢測實(shí)驗(yàn)中酶免疫分析程序：1、濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時(shí)與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。2、取所需數(shù)量的板條插入微孔架，用洗液洗滌微孔板3min×2次。3、加入50mL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到微孔，記錄樣品及標(biāo)準(zhǔn)的位置，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。4、加入50mL抗體溶液到每個(gè)微孔(注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染)中，37℃孵育90min。甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。每孔加入酶標(biāo)物100mL，37℃孵育60min。用洗液洗滌微孔板3min×5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。5、每孔加入顯色液100mL(2滴)，37℃孵育10~12min。6、每孔加入終止液50mL(1滴)，立即用酶標(biāo)儀在波長450nm處測定吸光度值(OD值)。在定量分析中，顯色液和終止液需要用移液器準(zhǔn)確量取。
六、黃曲-mei素檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)樣品濃度計(jì)算方法：以標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值與標(biāo)準(zhǔn)1OD值的比值為縱坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(ng/mL)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值與標(biāo)準(zhǔn)1OD的比值，可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為AFB1濃度的對(duì)數(shù)值，求得反對(duì)數(shù)即為測定液中AFB1濃度C(ng/mL)，按下列公式計(jì)算出樣品中AFB1含量：AFB1含量(mg/kg)= C×K式中：C：稀釋后樣品提取液中AFB1含量(ng/mL)K：樣品稀釋倍數(shù)(按照本說明書中樣品處理程序方法為25)
七、試劑主要技術(shù)指標(biāo)及參數(shù)
測試盒zui低檢出濃度0.1ng/mL，回收率70%~120%，與AFB2的交叉反應(yīng)系數(shù)小于1%，與AFG1的交叉反應(yīng)系數(shù)為4.65%，與AFG2交叉反應(yīng)系數(shù)小于1%。試劑盒校正曲線的線性范圍0.1~1.0ng/mL，試劑盒條內(nèi)變異<10%，條間變異<15%。
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